小分子誘導的靶蛋白選擇性降解是目前最有前途的新一代藥物發(fā)現(xiàn)方法之一。以 PROTACs（PROteolysis-TArgeting Chimeras）為例，雙功能小分子可以誘導靶蛋白連接到E3連接酶上，隨后形成靶蛋白/PROTAC/連接酶三元復合物，促進細胞靶蛋白通過蛋白酶體降解（下圖）。

由于PROTAC的二價性質，三元復合物的形成從根本上說是一個多過程。PROTAC分子可以首先與目標蛋白質結合，如果與連接酶的親和力較高，則連接酶結合后很可能會啟動三元復合物的形成。如果PROTAC與一種蛋白質的結合因另一種蛋白質的存在而增強或減弱，要充分理解平衡，就必須將協(xié)同效應在內（下圖）。在存在協(xié)同效應的情況下，相互作用不再是獨立的--正協(xié)同是由于與中心分子結合的其中一種成分促進了三元復合物的形成，而負協(xié)同則意味著這種結合抑制了進一步的相互作用。

而下圖中所呈現(xiàn)的曲線則展示了基于PROTAC的系統(tǒng)的另一個特點，三元復合物平衡呈現(xiàn)鐘形劑量反應曲線。在這個系統(tǒng)中，增加PROTAC的總濃度會導致三元復合物濃度降低（也稱為 "鉤子效應"），大量過剩的PROTAC會使目標蛋白和連接酶各自達到飽和。如果 PROTAC 濃度設置得過高，在某些情況下可能會導致檢測不到這些三元復合物。

預測這種臨界濃度和促進正協(xié)同效應以提高三元復合物的穩(wěn)定性，被認為都是PROTAC誘導的三元復合物形成的有效方案。

與其他方法相比，質量光度法（MP）實驗不需要對蛋白質進行標記或固定，可對溶液中的真實分子行為進行直接可視化和量化，因此可以對三元復合物形成的關鍵環(huán)節(jié)提供重要數據。

我們這次實驗使用了一個經過充分研究的BRD4（包含兩個溴結構域BD1和BD2）、VHL/ElonginC/ElonginB連接酶復合物和MZ1（PROTAC）系統(tǒng)。BRD4的失調與多種癌癥的發(fā)病有關，基于PROTAC技術的BRD4降解器已成為一種新型療法。

下圖顯示了質量分布隨MZ1濃度增加而變化的情況。BRD4和實驗中使用的 VHL/ElonginC/ElonginB連接酶復合物的分子量非常相似：VHL為 41.3 kDa，含有BD1和BD2 結構域的BRD4為 47.5 kDa。據報道，MZ1與VHL的親和力為～100 nM，而BD1和BD2的溴化結構域都能與MZ1結合，對結構域的測量結果分別為 380 nM（BD1）和120 nM（BD2）。BRD4的濃度為 50 nM，而VHL/ElonginC/ElonginB連接酶復合物的濃度調整為100 nM。在實驗中，三元復合物（所有BRD分子都參與）的完全形成將導致兩個峰值，一個在50 kDa（剩余的VHL），一個在100 kDa（BRD4-MZ1- VHL復合物），檢測到的事件數量大致相同。MZ1 濃度為1200 nM時，VHL和BRD4達到飽和狀態(tài)，三元復合物的濃度驟降。

正如預期的那樣，在沒有PROTAC的情況下，檢測到一個約50 kDa的單峰，表明BRD4和VHL之間沒有蛋白-蛋白相互作用（VHL和BRD4之間的質量差無法分辨）。在 20 nM MZ1 時，就出現(xiàn)了第二個群體，對應于BRD4-MZ1-VHL復合物。50 kDa的峰值對應于游離的VHL 和BRD4，以及與PROTAC分子的復合物，由于質量差異較小，這些復合物無法分辨。將 MZ1 濃度提高到100 nM會進一步增加BRD4-MZ1-VHL三元復合物的比例，并導致 BRD4-MZ1?-VHL?二元復合物的形成。由于VHL的濃度是BRD4的兩倍，因此 50 kDa 處的剩余峰值主要反映了游離連接酶的情況。當 PROTAC 濃度超過 1000 nM 時，觀察到形成的三元復合物數量突然下降，這是二元相互作用取代三元復合物形成的結果。

綜上所述，質量光度法可用于檢測三元復合物的形成，并量化中間物種的相對濃度。重要的是，其結果是在溶液中獲得的，在溶液中所有成分都存在并可自由相互作用，這與其他方法截然不同，后者只能將 "預形成 "的二元復合物與其中一種成分結合，以評估協(xié)同效應。此外，由于質量光度實驗不需要標記或固定，并且可以在nM濃度下工作，因此大大節(jié)省了時間和材料，從而可以對生理相關蛋白質濃度下的相互作用進行詳細表征。